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利用正向及反向遺傳學研究斑馬魚心臟之型態形成

為了解決螢光魚種類的問題，作者林哲毅 這樣論述：

脊椎動物胚胎發育過程中，心臟是第一個形成且具有功能的器官。心臟的正常發育，包含了心臟前驅細胞的移動、心肌及心內皮細胞的分化及生長、心房心室的形成等過程皆受到嚴謹且複雜的基因調控，這些過程一旦出錯將導致心臟不正常的發育。本論文使用斑馬魚為模式生物來研究心臟發育過程中有關心臟前驅細胞移動及後續心臟彎曲等形態形成之調控機制。斑馬魚為硬骨魚類，其胚胎發育中基因的調控機制與哺乳類相似，且具有包括性成熟時間短、單次產卵數目高、魚體透明易於觀察、基因組已完全解碼、體外受精利於基因操作、基因操作工具多等優點，使得斑馬魚近年來成為一研究脊椎動物遺傳與發育的良好模式生物。本論文包括兩部分，分別利用正、反向遺傳學

來研究斑馬魚心臟發育過程中有關心臟前驅細胞移動及後續心臟彎曲等形態形成之調控機制。在第一部份正向遺傳學方面，我們利用ENU (ethylnitrosourea)化學突變劑來處理BMP4:EGFP螢光魚，篩選出一隻心臟發育異常的突變斑馬魚(s1pr2as10)。大部分的突變魚在受精後28小時前(28 hpf)的胚胎，可觀察到具有兩顆獨立的心臟，而過了28 hpf後，此兩顆心臟會逐漸部分融合在一起，而形成類似兩生類之兩心房一心室的心臟。基因定位結果顯示突變魚中有一段外來的序列插入在edg5/mil基因座的intron1上造成該基因表現下降。此外，我們發現將s1pr2as10突變魚胚胎培養在較低的溫

度 (22.5℃) 時，發育到72 hpf的胚胎會形成正常的1心房1心室的心臟，且具有正常的血液循環。另外因注射gata5或bon專一性反意morpholino寡核酸所產生兩側心臟的胚胎，其心臟細胞移動的缺陷，亦能因培養在22.5℃的溫度下而被拯救。我們利用DNA microarray、digital基因表現分析、反意morpholino寡核酸弱化及mRNA或蛋白質過度表現等方式，發現fibronectin1，tenascin-c以及tenascin-w等細胞外基質基因對於低溫救回兩顆心臟是必須的。此外我們亦發現低溫可能會引發過氧種類(reactive oxygen species)而參與低溫

救回兩顆心臟的過程。在第二部份反向遺傳學方面，我們利用反意morphlino寡核苷酸基因弱化來探討斑馬魚Krüppel like factor 8 (Klf8)轉錄因子在心臟彎曲時所扮演的角色。在注射klf8專一性的反意morphlino寡核苷酸的72 hpf胚胎中，其心臟呈現拉直的情形。18-22體節klf8 morphant胚胎中，應表現在左側側板中胚層、間腦或心臟的spaw，lft1，lft2以及pitx2其mRNA的表現呈現下降或消失的情形。相反地，我們過度表現klf8 mRNA觀察到大部份被注射的胚胎中Nodal訊息傳遞成員基因皆在胚胎的左右兩側表現。另外我們發現斑馬魚spaw in

tron1中具有不同魚類高度保守的151 bp序列，其中分別含有兩個FoxHI及SMAD結合序列。將此保守的序列接在spaw基本啟動子5端(spaw bp_In1)，來驅動綠色螢光蛋白質的表現時，發現大部份被注射的18-20體節胚胎表現綠色螢光蛋白質在左側側板中胚層。同時一同注射Spaw bp_In1質體及klf8 mRNA，可以驅使更多的胚胎中綠色螢光蛋白質表現在側板中胚層，而在共同注射klf8反意morphlino寡核苷酸及Spaw bp_In1質體的胚胎中，則幾乎沒有綠色螢光蛋白質的表現。這些實驗結果顯示斑馬魚Klf8轉錄因子會調控spaw在左側側板中胚層的表現，進而調節心臟的左右不對稱

的形態形成。

雙連埤水族動物群聚之時空變化及青鱂魚小型模場復育之研究

為了解決螢光魚種類的問題，作者錢佳佑 這樣論述：

本樣區的環境生態調查自2008年8月起至2009年12月間，合計11次在雙連埤湖域利用各式漁法調查湖域內魚類物種，並記錄水質資料。另在室內實驗以小型飼育箱仿照其環境，模擬大肚魚入侵青鱂魚棲地，以及復育期間兩物種在共域環境下的互動模式，並觀察兩者的增殖率。發現青鱂魚在移入新環境中，須約一個月左右的適應期，在此適應期內其生殖現象會暫停；若在原只有青鱂魚的環境中放入大肚魚，則青鱂魚會有明顯的成群性。另外，水下植物的有無對於青鱂魚子代的產出有絕對性的影響。根據小型模場的共域環境試驗初步結果顯示，若要在埤內進行青鱂魚的原地復育計畫，建議仍有必要清除雙連埤湖域內的外來物種如草食性魚類及生態區位相近的大肚

魚；由實驗結果可知埤內植物相的復原進度與青鱂魚及食草性魚類等物種有密切相關性。